Hücre Canlılığı, Hücre Sitotoksisitesi, Hücre Çoğalması, Hücre Döngüsü ve Apoptoz Analizleri
Bir hücre sağlığı analizine ihtiyaç duyduğunuzda seçeneklerinizi bilin.
Hücre canlılığı, hücre sitotoksisitesi (zehirlenmesi), hücre döngüsü durumu, hücre çoğalması ve hücre ölümü, çoğu hücre temelli çalışma için son derece önemlidir. Hücre sağlığı analizi yapmanız gerektiğinde seçeneklerinizi öğrenmek için bu kılavuzu kullanın.
Deneysel ihtiyaçlarınıza uyan doğru analizi seçin:
– Hücre metabolizması / enzim aktivitesi temelli hücre canlılığı ve hücre zehirlenmesi analizleri
Metabolizma gibi, devamlı olan hücresel aktivitelerin değerini ölçün.
– Sitoliz / membran sızıntısı temelli hücre canlılığı ve hücre zehirlenmesi analizleri
Hücresel enzimlerin sızıntısını ölçerek ya da membranın geçirmediği boyalarla boyayarak membran hasarını analiz edin.
– Hücre çoğalması ve hücre döngüsü analizleri
Bir hücre popülasyonunun artışını gözlemleyin, yavru hücrelerin oluşumlarını tespit edin ya da bir hücre popülasyonunun hücre döngüsü durumunu inceleyin. Hücre canlılığı analizi yapmak için bu testleri kullanabilirsiniz.
– Hücre ölümü analizleri/ apoptoz analizleri
Farklı hücre ölümü türlerinde bulunan göstergeleri ölçün.
Unutmayın: Hiçbir yöntem, hücre canlılığı, hücre çoğalması ya da hücre ölümü ile ilgili mükemmel bir görüş sağlamaz. Birkaç farklı yöntemi birleştirmek, neredeyse her zaman en faydalısıdır.
Hücre canlılığı ve hücre zehirlenmesi analizleri: hücre metabolizması ve enzim aktivitesi
Hücre canlılığının ve hücre zehirlenmesinin (sitotoksisite) miktarını belirlemek adına, sürmekte olan hücresel metabolizmanın ve enzim aktivitesinin analizini yapmak için birkaç yöntem kullanabilirsiniz.
Bu yöntemler:
– Hücresel enzimler tarafından indirgenen boyaları,
– Mitokondriyal membran potansiyeli bağlı floresan boyaları,
– Hücresel esteraz bağlı floresan boyaları,
– ATP ve ADP analizlerini,
– Glikolitik akış ve oksijen tüketimini ölçen analizleri içermektedir.
Daha fazla bilgi sahibi olmak için ya da mitokondri, oksidatif stres, metabolitler ve metabolik aktivite hakkında daha fazla inceleme için bkz. www.abcam.com/metabolismassays.
Boya indirgeme analizi
Tetrazolyum hücre canlılığı analizleri, soğurma ile ölçülen renkli bir formazan ürünü oluşturmak için hücresel dehidrojenaza ihtiyaç duyar. Diğer analizler, floresan rezorüfin oluşturmak için mitokondriyal solunum zincirinden elektron alımıyla resazurin indirgemeyi kullanır.
Şekil 1. Boya indirgeme analizine genel bakış
Tetrazolyum Grubu
Analiz | Araç | Açıklamalar | Analiz kitleri |
MTT |
Plaka okuyucu | İlk tetrazolyum analizi; hala çok popüler. Bir yıkama/ çözünürleştirme adımı gerektiren tek tetrazolyum analizi. | ab211091 |
MTS | En popüler analiz. Kullanımı WST-1’den daha yaygındır. | ab197010 | |
WST-1 | MTT, XTT ya da MTS’den daha hassastır. | ab155902 ab65473
| |
Hücre Sayım Kiti-8 / CCK-8 / WST-8 |
| ab228554 ab65475 | |
XTT analizi |
| ab232856 |
Resazurin Grubu
Resazurin, ThermoFisher’s alamarBlue®’nun etken maddesine eşdeğerdir.
Analiz | Araç | Açıklamalar | Analiz kitleri |
Resazurin | plaka okuyucu, mikroskop, flow sitometri | Florometrik (Ex/Em 535–560/560–615) ya da kolorimetrik. Yıkama olmayan analiz. Floresan okuma, diğer analizlerle çoğullama sağlar.
| ab129732 ab112119 |
Şekil 2. İdarubisin (A) ya da staurosporin (B) ile muamele edilen Jurkat hücreleri, Resazurin (ab129732) ile incelenmiştir.
Mitokondriyal membran potansiyeline bağımlı boyalar
Mitokondriyal membran potansiyeli sayesinde mitokondride biriken birkaç boya mevcuttur ve canlı hücreleri tespit etmek için bunları kullanabilirsiniz. Bir membran potansiyeli kaybı ve boyama kaybı, apoptoz analizi yapmak amacıyla kullanılır.
Analiz | Araç | Açıklamalar | Analiz kitleri |
TMRE/TMRM |
Plaka okuyucu, mikroskop, flow sitometri | En popüler Abcam mitokondriyal membran boya analizi. Ex/Em 549/575 nm. Fiksasyondan sonra mitokondriden yıkanarak çıkarılır. | ab113852 |
JC-1/JC-10 | JC-1 (Ex/Em 530/530–570) ve JC-10 (Ex/Em 590/520–570), yüksek konsantrasyonlarda kırmızı agregat oluşturur (yığılmayan boya yeşildir). Membran potansiyeli kaybı, boya kaybına neden olur ve yeşil floresanı arttırır. Fiksasyondan sonra yıkanarak çıkarılır. | JC-1: ab113850 ab288313
JC-10 (JC-1’den daha çözünürdür): ab112134 ab112133 | |
Mitotracker Red | Ex/Em 579 /599. Fiksasyondan sonra yıkanarak çıkarılmaz. |
| |
Rhodamine 123 | Ex/Em 507/529. Fiksasyondan sonra yıkanarak çıkarılır. |
| |
NIR | Plaka okuyucu, flow sitometri | Ex/Em 635/660. | ab112149 ab112150 |
Orange | Ex/Em 540/590. | ab138898 ab138899 |
Şekil 3. TMRE kit ab113852 ile hücre boyama. A: Sağlıklı HeLa hücreleri, B: Sağlıklı Jurkat hücreleri.
Esteraz Cleavage
Kalsein ve benzer hidrofobik boyalar hücrelerin içine yayılır ve canlı hücrelerde hücre içi esterazlar tarafından bölünür. Hidrofilik floresan ürünü, hücre içinde tutulur.
Analiz | Araç | Açıklamalar | Analiz kitleri |
Calcein AM | Plaka okuyucu, mikroskop, flow sitometri | Ex/Em 495 / 515 nm | ab228556 ab270789 ab270788 |
Calcein violet AM | Plaka okuyucu, mikroskop, flow sitometri | Ex/Em 405/460 nm | ab176748 |
Esteraz-bölünme mavi | Plaka okuyucu | Ex/Em 360/450 nm | ab112120 |
Esteraz-bölünme yeşil | Plaka okuyucu, mikroskop | Ex/Em 490/520 nm | ab112122 |
ATP analizleri
Çoğu analiz, ATP’yi açığa çıkarmak için bir hücre membranını geçirgen hale getirme maddesi kullanır; ışık, ATP-bağımlı lusiferaz kullanılarak üretilir. Diğer ATP analizleri, ATP-bağımlı gliserol fosforilasyonunu (ya da diğer substratları) kullanır.
Analiz | Araç | Açıklamalar | Analiz kitleri |
Lüminesans ATP analizi |
Lüminometrik plaka okuyucu | Yıkama olmayan analiz | ab113849 |
ATP fosforilasyon analizi |
Plaka okuyucu | Hücre lizatlarıyla kullanılan, yıkama olmayan analiz. Lüminesans analizler kadar hassas değil. Florometrik (Ex/Em 535/587 nm) kolorimetrikten daha hassastır. | ab83355 |
Oksijen tüketimi ve glikoliz analizleri
Oksijen tüketim hızı, hücresel metabolik aktivitenin düzeyini gösterir. Hücre içi oksijen düzeyleri ve glikoliz aktivitesi analizleri, daha derin incelemeye olanak sağlar.
Analiz | Araç | Açıklamalar | Analiz kitleri |
Hücre dışı oksijen tüketimi |
Plaka okuyucu | Yıkama olmayan analiz. Boya sinyali (Ex/Em 380/650 nm), O2 düzeyini respirasyonun alt segmentlerine kadar yükseltir. Belli bir araca gerek yoktur. | ab197243 |
Hücre içi oksijen düzeyleri |
Plaka okuyucu | Boya floresanı (Ex/Em 340/642), hücre içi oksijenle söndürülür. Yıkama olmayan analiz. | ab197245 |
Glikoliz aktivite | Yıkama olmayan analiz. Laktat üretimi, hücre dışı asitlendirmeye ve artan boya floresanına sebep olur (Ex/Em 340-380/615 nm). | ab197244 |
Şekil 4. Antimisin A ve FCCP ile muamele edilen ve ATP (gri, ab113849), oksijen tüketimi (beyaz, ab197243) ve glikoliz (siyah, ab197244) ile analiz edilen HepG2 hücreleri.
Hücre canlılığı ve hücre sitotoksisite analizleri: sitoliz ve membran sızıntısı
Ciddi hücresel hasar ya da hücre ölümü ile ilgili analiz yapmak için membrandaki hasara bakabilirsiniz.
Yöntemler şunları içerir:
– Hücre dışına sızan enzim aktivitelerinin ölçümü
– Membran hasarı nedeniyle hücrelere giren ve onları boyayan, sağlıklı membranın geçirmediği boyalar
– Amin-reaktif boyalar, canlı hücrelerin yüzeyine güçsüz bir şekilde bağlanır ve ölü hücrelerde daha parlak bir boyanma oluşturur.
Membranın geçirmediği boyalar, canlı hücreleri boyayan boyalarla, ortak canlı / ölü hücre analizlerinde sıklıkla kullanılır.
Enzim sızıntısı
En bilinen enzim sızıntısı hücre canlılığı analizi, laktat dehidrojenaza yöneliktir.
Analiz | Araç | Açıklamalar | Analiz kitleri |
LDH/Laktat dehidrojenaz | Plaka okuyucu | LDH, laktatı oksitler ve renkli ya da floresan (Ex/Em 535/587 nm) bir ürün oluşturur. | ab65393 ab197004 ab65391 |
AK/Adenilat kinaz | Plaka okuyucu | AK, ışıma üreten lüsiferaz yoluyla deteksiyon ile ADP’yi ATP’ye dönüştürür. AK aktivitesi, LDH kadar dayanıklı değildir. |
Şekil 5. Staurosporin ya da sikloheksimid HeLa hücreleri, muamele edilmemiş hücreler, LDH pozitif kontrolü ve lysed hücre ile kullanılan LDH analizi.
Membranın geçirmediği boyalar
Hücre canlılığı analizleri sıklıkla, hasarlı hücre zarlarıyla hücreleri boyayan membranın geçirmediği floresan boyaları (çoğunlukla DNA boyaları) kullanır. Propidyum iyodür, geniş emisyon spektrumu ve canlı hücrelere bağlanma eğilimi sebebiyle, hücre canlılığı analizleri için DRAQ7™ ve 7-AAD ile büyük ölçüde yer değiştirmiştir.
Analiz | Araç | Açıklamalar | Analiz kitleri |
DRAQ7 |
Flow sitometri, mikroskop | Ex/Em 633 & 647/665–800 nm. DNA boyası. | ab109202 |
7-AAD | Ex/Em 488/647 nm. DNA boyası. | ab228563 ab270780 | |
Propidyum İyodür | Ex/Em 536/617 nm. DNA boyası. Zamanla hücrelerden sızar. | ab14083 ab139418 ab65470 | |
Etidyum homodimer-1 | Ex/Em 528/617. DNA boyası. | ab145323 | |
Tripan mavisi |
Mikroskop | Floresan olmayan hücre boyası. Hücre sayımı gerektiren klasik hücre canlılığı analizi. Uğraştırıcıdır ve manuel hata yapılmasına yatkındır. |
|
Şekil 6. Hücre ölümünü başlatmak için staurosporinle muamele edilen Jurkat hücreleri, DRAQ7™ boyamasını gösterir (grafiğin üst yarısı).
Canlı - ölü hücre analizleri için amin-reaktif boyalar
Amin-reaktif boyalar, hücre yüzey aminlerine bağlanarak, canlı hücreleri güçsüz bir şekilde ve hücre içi aminlerle reaksiyona girerek kuvvetli bir şekilde boyar. Ölü ve canlı hücreler, floresan düzeyiyle ayırt edilebilir.
Analiz | Araç | Açıklamalar | Analiz kitleri |
Amin-reaktif boyalar
|
Flow sitometri | Ex/Em 410/450 nm. Fiksasyon uyumlu (bu tablodaki tüm boyalara uygulanır). | ab176738 – mavi |
Ex/Em 408/512 nm | ab176739 – yeşil | ||
Ex/Em 398/550 nm | ab176740 – oranj | ||
Ex/Em 353/442 nm | ab176741 – mavi | ||
Ex/Em 498/521 nm | ab176742 – yeşil | ||
Ex/Em 547/573 nm | ab176743 – oranj | ||
Ex/Em 583/603 nm | ab176744 – kırmızı | ||
Ex/Em 649/660 nm | ab176745 – koyu kırmızı |
Canlı- ölü hücre analizleri için kombine çoklu boyalar
Çoklu boyalar, tek bir canlı / ölü hücre analizinde birlikte kullanılabilir. Örnekler arasında, ölü hücreleri ve canlı hücreler için bir esteraz bölünme boyasını etiketlemek amacıyla etidyum homodimerli bilindik bir canlı ve ölü hücre analizi (ab115347) bulunmaktadır. Alternatif olan hücre canlılığı analiz kiti (florometrik- yeşil/ kırmızı iki boyalı) (ab112121), ölü hücreler için kırmızı bir DNA boya ve canlı hücreler için yeşil bir esteraz bölünme boyası içerir.
Soldaki Şekil 7. Canlı hücreler (sol üstte) ve ölü hücreler (sağ altta) ile kullanılan canlı: ölü hücre analizi (ab115347). Sağdaki: ab115347 ile boyanmış, etoposid uygulanmış hücreler. Canlı hücreler yeşile boyanır ve ölü hücreler kırmızıdır.
Hücre çoğalması ve hücre döngüsü analizleri
Bu analizler, bir hücre popülasyonunun çoğalma hızını gözlemler, artan bir popülasyonda yavru hücreleri tespit eder ya da hücre döngüsünün farklı evrelerinde hücrelerin uyumlarını analiz eder.
Yöntemler:
– Hücre döngüsü analizleri için DNA boyaları
– Boya indirgeme analizleri
– DNA sentezleri boyunca nükleosit analoglarının özümsenmesini içerir.
DNA boyaları
DNA boyaları, genellikle hücre popülasyonlarındaki DNA miktarını ölçmek için ve hücre döngüsü durumu analizi için flow sitometride kullanılır. Propidyum iyodür, en yaygın kullanılan boyadır.
Boya | Araç | Açıklamalar | Analiz kitleri |
Propidyum iyodür |
flow sitometri | Ex/Em 536/617 nm | ab14083 ab139418 |
Çekirdek Yeşil CCS1 | Ex/Em 490/525 nm | ab112116 | |
Çekirdek Kırmızı CCS1 | Ex/Em 490/620 nm | ab112117 | |
DRAQ5 | Ex/Em 633&647/665–800 nm | ab108410 | |
DAPI | Ex/Em 358/461 | ab228549 ab285390 | |
Hoechst 33342 | Ex/Em 350/461 | ab228551 | |
Hoechst 33258 | Ex/Em 350/461 | ab228550 | |
7-AAD | Ex/Em 488/647 nm | ab228563 |
Şekil 8. Timid (B) ve nokodazol (C) uygulanmış HeLa hücreleriyle kullanılan propidyum iyodür flow sitometri kiti (ab139418). Tepe noktaları 2N ve 4N DNA miktarını gösterir.
Boya indirgeme (dilution) analizleri
Boya indirgeme analizlerindeki boyalar, çoklu üreme vasıtasıyla hücrelerde tutulur. Yavru hücreler, ana hücrelerin boyasının yarısını alır ve deneyler bir flow sitometride analiz edilir. Karboksifloresin süksinimidil ester (CFSE) en uzun süre kabul görmüş boyadır.
Boya | Araç | Açıklamalar | Analiz kitleri |
CFSE |
flow sitometri | Ex/Em 492/517 nm. Yüksek konsantrasyonlarda sitotoksik. | ab113853 |
Mavi |
flow sitometri, mikroskop | Ex/Em 403/454 nm | ab176726 |
Yeşil | Ex/Em 511/525 nm | ab176735 | |
Koyu Kırmızı | Ex/Em 628/643 nm | ab176736 | |
Oranj | Ex/Em 542/556 nm | ab176737 |
Şekil 9. CFSE (ab113853) indirgeme deneyinin flow sitometri analizleri.
Nükleosit analogları
Bromodeoksiüridin (BrdU) ve etinildeoksiüridin (EdU) analizleri, DNA replikasyonu süresince yeni sentezlenmiş DNA’nın içine BrdU ya da EdU yerleşimini ölçer. Antikorlar kullanılarak saptanan BrdU’nun aksine, EdU ya bir floresan boyayla ya da streptavidin-HRP yoluyla kolorimetrik veya florometrik deteksiyon biyotini ile kolaylıkla doğrudan tanımlanabilir. Edu boyama, daha sert BrdU protokolünün aksine, başka bir antikor boyamasıyla tutarlıdır.
Analiz | Araç | Analiz kitleri |
EdU | Mikroskop, flow sitometri, plaka okuyucu | ab219801 ab222421 |
BrdU | Plaka okuyucu, mikroskop | ELISA: ab126556 ab126572
IHC: ab125306 |
Şekil 10. HeLa hücrelerinin çoğalmasını gösteren EdU boyaması. DNA (mavi), Hoechst 33342 (ab145597) ile boyanmıştır. Yeşil hücreler, EdU + Hoechst-pozitiftir.
Hücre çoğalması analizi için diğer yöntemler
Doku örneklerinde ya da bazen hücre kültürlerinde hücre çoğalması analizleri için, numunede Ki67 ya da PCNA miktar ölçümünü boyama ile yaparken antikorların kullanımı yaygındır.
Yüksek verimde çok az kullanılmasına rağmen, hücre çoğalması analizi uygulamanın klasik yöntemi, bir kromojenik analiz kullanmaktır. Bu analizde, hücreler, düşük bir yoğunlukta plakalanır ve daha sonra oluşan kolonilerin miktarı sayılır.
Hücre yaşlanması (Senescence) analizi
Yaşlanan hücrelerin en yaygın göstergesi, hücre içinde meydana gelen lizozomal beta-galaktosidaz (SA-beta-gal)’ın aşırı ekspresyonu ve yığılmasıdır. Beta-gal aktivitesi, kolorimetrik ya da florometrik bir substrat kullanılarak saptanır.
Analiz | Araç | Analiz kitleri |
Beta-gal | mikroskop, plaka okuyucu | ab65351 |
Hücre ölümü-apoptoz analizleri
Hücre ölümünün farklı türlerinde ve farklı evrelerinde aktif hale gelen göstergeleri ölçerek hücrelerin nasıl öldüğünü belirleyebilirsiniz.
Yöntemler
– Hücre yüzeyi fosfatidilserinin Annexin V bağlanmasını,
– DNA kondensasyonu ve fragmentasyonu (TUNEL) analizlerini,
– Kaspaz aktivasyonu ve deteksiyonu analizlerini,
– Mitokondriyal membran potansiyeli bağlı boyaları,
– Sitokrom C salınımı analizlerini,
– Glutatyon analizlerini,
– Nekroz, anoikis ve otofajiye dair analizleri içerir.
Hücre ölümünün daha detaylı bir incelemesi için ve onu araştıran analizler için, apoptoz, nekroptoz ve otofaji ile ilgili üç adet kapsamlı kılavuzumuza bakınız.
Annexin V analizi
Annexin V, apoptozda, dış plazma membranına geçen fosfatidilserine bağlanır. Analizler, genellikle flow sitometriyle yapılır. İntakt, apoptotik ve nekrotik hücreler arasında ayrım yapmak için 7-AAD gibi membranın geçirmediği bir boya ile Annexin V’yi eşleştirin (örn. ab214663, ab214484, ya da ab214485).
Annexin V konjugat | Ex/Em | Analiz kitleri |
FITC | 495/519 | ab14085, ab14082 |
Cy5 | 647/665 | ab14150, ab14147 |
APC | 650/660 | ab236215 |
CF Blue | 408/452 | ab214663, ab214485 |
DY-634 | 635/658 | ab214484 |
iFluor 488 | 491/516 | ab219916, ab219904 |
iFluor 594 | 585/606 | ab219918, ab219906 |
iFluor 555 | 556/574 | ab219917, ab219905 |
iFluor 647 | 654/670 | ab219919, ab219907 |
iFluor 680 | 684/701 | ab219908 |
mFluor Violet 450 | 406/445 | ab219911 |
EGFP | 488/530 | ab14153 |
Biyotin |
| ab273267 |
Şekil 11. Murin trombositleri, annexin V-FITC’nin bulunduğu CRP ile uyarıldı. Annexin V-pozitif popülasyonu (AnV +ve) gösterilmektedir.
DNA kondensasyonu-fragmentasyonu
Apoptozdaki DNA kondensasyonu, yoğunlaşmış çekirdekleri görselleştirmek için DNA boyaları kullanılarak ölçülebilir.
DNA fragmentasyonu, agaroz jeller kullanılarak ölçülebilir. TUNEL analizinde, DNA parçacıklarının 3’ ucu, bir floresan boyaya ya da biyotine konjuge edilmiş deoksiüridin ile işaretlenebilir.
Analiz | Araç | Analiz kitleri |
DNA fragmentasyonu | Jel elektroforez | ab66090 |
TUNEL | Flow sitometri, floresan mikroskop, ışık mikroskop | ab66108, ab66110, ab206386 |
Şekil 12. DAPI karşıt boyama (mavi) ile, kırmızı TUNEL kiti (ab66110) kullanarak, Hydractinia echinata’daki TUNEL boyama.
Aktif kaspaz analizi
Aktifleştirilmiş kaspazlar, IHC, Western Blot ya da flow sitometri teknikleri ile antikorlar kullanılarak saptanabilir.
Kaspaz aktivitesi analizleri, ya hücre ekstraktlarındaki kaspazlarla bölünen peptit substratları ya da canlı hücrelerde aktifleştirilmiş kaspazlara bağlanan benzer substratları kullanır. Kaspaz özgüllüğü, substrata göre değişir.
Plaka okuyucu ile analiz edilen hücre lizatları için ya da flow sitometri, mikroskop ya da plaka okuyucu ile analiz edilen canlı hücreler için formüle edilmiş, 1’den 12’ye kaspazlara ilişkin analizlerimiz hakkında bilgi için tıklayınız.
Ayrıca, katepsin ve kalpain aktivitesi analizleri için önerdiğimiz analizler şunlardır: katepsin D (ab65302), katepsin K (ab65303) ve kalpainler (ab65308).
Mitokondriyal membran potansiyeline bağımlı boyalar
Mitokondriyal membran potansiyeli dolayısıyla mitokondride biriken boyalar, apoptozun incelenmesinde de kullanılır. Daha fazla bilgi için, metabolizma temelli analizler hakkındaki önceki bölüme bakınız. Apoptotik hücreler, membran potansiyeli kaybı yüzünden, bu boyalarla daha güçsüz bir şekilde boyanır.
Sitokrom C salınımı
Sitokrom C, mitokondriyal membran potansiyelinin tamamen kaybı sonrasında sitoplazmaya salınır.
Analiz | Araç | Analiz kitleri |
Sitokrom C | Western blot, floresan mikroskop | ab110415, ab110417, ab65311 |
Glutatyon analizi
Glutatyon analizleri, apoptoz analizleri için de kullanılır.
Analiz | Araç | Analiz kitleri |
GSH/GSSG analizi – yeşil | Florometrik plaka okuyucu | ab138881 |
Nekroz, anoikis, otofaji
Hücre ölümünün diğer türlerini çalışmak için birkaç kit öneriyoruz:
- Nekroz ve apoptoz için ab176749 ve ab176750,
- Anoikis için ab211153,
- Otofaji için ab139484,
Otofaji ve sitotoksisite için ab133075 katalog numaralı kitleri öneriyoruz.
