GAPDH, aktin, GFP ve tübülin gibi hedeflere karşı kullanılan yükleme kontrol ve etiket antikorları, deney sonuçlarınızın doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için kritik öneme sahiptir. Özellikle, sağlam verilerin çok önemli olduğu yüksek etkili dergilerde deneyler yayımlarken bu antikorların rolü daha da belirginleşir.
Abcam, çeşitli uygulamalarda yüksek performans, tutarlılık ve kapsamlı doğrulama sağlayan geniş bir yükleme kontrol ve etiket antikorları yelpazesi sunar. Yüksek dilüsyon faktörü, antikor şişesi başına daha fazla deney yapmanızı sağlayarak optimizasyon ihtiyacını en aza indirir. Yeni düşük fiyatlarla birleştiğinde, bu, olağanüstü bir değer sunar ve araştırmanızı daha hızlı bir şekilde ilerletmenize yardımcı olur.
Kapsamlı yükleme kontrolleri ve etiket antikorları yelpazemizi inceleyin.
Western Blot İçin Tavsiye Edilen Kontroller
Western blot deneyinizi optimize etmek mi istiyorsunuz? Kemilüminesan ve floresan western blot için tavsiye edilen kontrolleri keşfedin.
Her deneyde kontrollerin bulunması gereklidir ve western blot da bu durumdan muaf değildir. Kontroller hem rastgele hem de sistematik olan beklenmeyen hataların sebeplerini fark etmenize ve sonuçlarınızı tehlikeye atmadan önce bunları düzeltmenize yardımcı olur.
Pozitif Kontrol Lizatı
Bir pozitif kontrol lizatı, tespit etmeye çalıştığınız proteini eksprese etmesiyle bilinen bir hücre hattından veya doku numunesinden elde edilen bir lizattır. Pozitif kontrolden elde edilen pozitif bir sonuç, test numuneleri negatif olsa bile, prosedürün ve reaktiflerin optimize olduğunu ve çalıştığını gösterecektir. Bu yüzden, herhangi bir negatif sonucun geçerliliğini doğrulayacaktır. Diğer yandan, pozitif kontrol şeridindeki negatif bir sonuç, protokolünüzdeki adımlardan en az birinin doğru bir şekilde çalışmadığını veya antikorunuzla ilgili bir problem olduğunu gösterecektir.
Yeni bir deneye başlarken bir pozitif kontrol lizatı kullanmanızı şiddetle tavsiye ediyoruz. Bu, protokole doğrudan güvenmenizi sağlayacaktır.
İpucu: Hedef proteininizin ekspresyonu iyi karakterize edilmezse, bir pozitif kontrol olarak ilgili proteininizi aşırı eksprese eden hücre hatlarından veya dokulardan elde edilen bir lizat kullanın. Bir pozitif kontrol olarak, hücre lizatı kullanmayı doku lizatı kullanmaya tercih ediyoruz; çünkü dokudaki protein ekspresyon seviyeleri, özgün farklılıklardan veya heterojeniteden kolayca etkilenebilir ve kolayca lizat parti farklılıklarına neden olabilir.
Fosforilasyon modifiye proteinler gibi modifikasyona uğramış hedefler için, bir kontrol olarak tam bir antikor kullanılmasını öneriyoruz. İlaç tedavisiyle düzenlenmiş proteinler için, sinyal yolağınızın başarılı bir şekilde aktive olduğunu doğrulamak için aynı sinyal yolağında bulunan bir kontrol antikoru kullanmanızı öneririz.
Antikor prospektüsünü kontrol etmenizi tavsiye ediyoruz; bu, genellikle size önerilen bir pozitif kontrol sunacaktır. Kullandığınız doku veya hücre hattının, test edilmiş bir türden elde edildiğinden her zaman emin olun. Tüm prospektüsler, önerilen uygun bir kontrol sunmayabilir. Bu durumda, aşağıdaki adımları uygulamanızı tavsiye ediyoruz:
- Antikora dair herhangi bir alıntı ve Abreview olup olmadığını kontrol edin. Bu müşteriler tarafından başarılı bir şekilde kullanılmış olan herhangi bir doku, hücre veya lizat, uygun bir pozitif kontrol olarak değerlendirilebilir.
- Prospektüsteki Swiss-Prot veya Omnigene veritabanı linklerini kontrol edin. Bu veritabanları genellikle, ilgili proteininizi eksprese eden dokuları listeler. Bunlar da uygun pozitif kontroller olarak değerlendirilebilir.
- Protein için GeneCards veya Human Protein Atlas kayıtlarını kontrol edin. Bu genellikle, çeşitli doku ve/veya hücre hatlarındaki ilgili protein seviyelerini size sağlayacaktır.
- Uygun bir kontrol bulmakta hala zorluk çekiyorsanız, hangi dokuların ve hücrelerin, ilgili proteini eksprese ettiğini görmek için PubMed’te hızlı bir literatür taraması yapmanızı öneririz.
Swiss-Prot, Omnigene veya Human Protein Atlas gibi online veri tabanlarını kullanıyorsanız, verinin nereden geldiğine dikkat edin; çünkü mRNA’ya dayalı veri, tespit edilebilen protein seviyeleriyle tam anlamıyla uyumlu olmayabilir.
Negatif Kontrol Lizatı
Negatif kontrol lizatı, tespit etmeye çalıştığınız proteini eksprese etmemesiyle bilinen bir hücre hattı veya doku numunesinden elde edilen bir lizattır. Bir negatif kontrol, antikorunuzun spesifik olmayan bağlanmasını ve yanlış pozitif sonuçları kontrol etmenize olanak tanıyacaktır.
İpucu: Bir negatif kontrol olarak, doğrulanmış bir nakavt hücre hattından veya doku numunesinden elde edilen bir lizat kullanın.
Yükleme Kontrolleri
Yükleme kontrolleri, inceliyor olduğunuz hücre türü veya numunede, yüksek düzeyde, temel ekspresyonu gösteren proteinlerdir. Aktin, GAPDH, tübülin veya mitokondriyal proteinler gibi referans genler genellikle iyi seçimlerdir.
Yükleme kontrolleri, protein yüklemenin jel boyunca aynı olduğunu doğrular ve böylece, tespit ettiğiniz protein seviyelerini normalleştirmenize yardımcı olur. Yükleme kontrolünün ekspresyon seviyelerinin, farklı numune türleri arasında tutarlı kalması gerektiğinden, yükleme kontrolleri ayrıca, numuneler arasındaki verilerinizin güvenilirliğini de sağlar.
Aşağıda, western blotta negatif kontrollerin ve yükleme kontrollerinin bir örneği bulunmaktadır (Şekil 1).
Şekil 1. Anti-beta actin antibody [AC-15] (ab6276) ile western blot. Şerit 1: Wild-tip HAP1 hücre lizatı (20 µg). Şerit 2: Beta-aktin nakavt HAP1 hücre lizatı (20 µg), bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Şerit 1 ve 2: Birleşmiş sinyal (kırmızı ve yeşil). Yeşil- 42 kDa’da gözlenen beta-aktin (ab6276). Kırmızı- 37 kDa’da gözlenen yükleme kontrolü (ab181602). Ab6276’in, spesifik olarak wild-tip HAP1 hücrelerinde beta-aktinle reaksiyona girdiği görülmektedir (şerit 1). Negatif kontrolde (şerit 2’deki beta-aktin nakavt hücre lizatı) hiçbir bant gözlenmemiştir.
Yükleme kontrolü kullanmanızı gerektiren temel sebepler aşağıda belirtilmiştir:
- Kantifikasyon: Şeritler eşit bir şekilde yüklenmediğinde, yükleme kontrolleri, yüklemedeki farklılıkları düzeltmek için yükleme kontrol bandının yoğunluğunu kullanarak, her bir şeritteki protein miktarını ölçmek için kullanılabilir.
- Eşit transfer: Yükleme kontrollerinin, western blotlarda bir kontrol olarak ikinci bir rolü vardır. Tüm jel boyunca, jelden membrana eşit transfer gerçekleştiğini kontrol etmek için kullanılabilirler. Bu, numuneler arasındaki protein ekspresyon seviyeleri karşılaştırıldığında zorunludur.
- Kenar etkisi: Bu, çok sayıda şeridin aynı anda çalıştırıldığı sinyal çalışmalarında veya deneylerinde oldukça önemli olan bir konudur. Jelin dış şeritlerindeki proteinler, kenara yakın bir konumdaki membranlara transfer edilir. Bu, jelin diğer bölgelerine kıyasla, bağlanmada daha fazla farklılığa sebep olabilir. Yükleme kontrolleri, bu etkinin meydana gelip gelmediğini gösterebilir ve bağlanmadaki farklılığı düzeltmemizi sağlar.
- Hakemlerin talepleri: Yükleme kontrolleri kullanmak, yayın kalitesi çalışması için önemlidir. Örneğin, bir makalenin, birçok Nature dergisinde yayımlanması için, dört genel kriteri karşılaması gerekmektedir. Bunların ilki, “sonuçlar için güçlü kanıtlar sağlamalı” dır. Bu doğrudan, elde edilen sonuçların geçerli olduğunu kanıtlamak için kontrollerin gerekliliğiyle ilişkilidir.
Numune türünüze göre en doğru yükleme kontrolünü seçmek için aşağıdaki tabloyu kullanın. Araştırdığınız proteininkinden farklı bir moleküler ağırlığı olan bir yükleme kontrolü seçmenin önemli olduğunu unutmayın. Bu, bantlar arasında ayrım yapabilmenizi sağlayacaktır.
kDa | Tüm hücre | Mitokondriyal | Çekirdek | Membran | Sitoskeleton | Serum |
125 | Vinkülin | – | – | – | – | – |
110 | – | – | – | NaK ATPaz | – | – |
75 | – | – | – | – | – | Transferrin |
66 | – | – | Lamin B1* | – | – | – |
60 | – | HSP60 | – | – | – | – |
55 | Alfa tübülin** | – | HDAC1 | – | Alfa tübülin ** | – |
50 | Beta tübülin** | – | YY1 | – | Beta tübülin ** | – |
42 | Aktin | – | – | – | Aktin | – |
40 | Beta-aktin*** | – | – | – | Beta-aktin*** | – |
35 | GAPDH† | – | TBP‡ | – | – | – |
30 | – | VDAC1/Porin | PCNA | – | – | – |
24 | Siklofilin B | – | – | – | – | – |
20 | Kofilin | COX IV§ | – | – | COX IV§ | – |
15 | – | – | Histon H3 | – | – | – |
*Çekirdek zarının çıkarıldığı numuneler için uygun değildir.
** Tübülin ekspresyonu, antimikrobiyal ve antibiyotik ilaçlara direncine göre değişebilir (Sangrajang S et al., 1998; Prasad V et al., 2000).
*** İskelet kası numuneleri için uygun değildir. Hücre büyüme koşullarındaki değişiklikler ve hücre dışı matris bileşenleri ile etkileşimler, aktin protein sentezini etkileyebilir (Farmer et al., 1983).
† Hipoksi ve diyabet gibi bazı fizyolojik faktörler, belli hücre türlerinde GAPDH ekspresyonunu arttırır.
‡ DNA’nın çıkarıldığı numuneler için uygun değildir.
§ Birçok protein, COX IV gibi 16 kDa boyutunda çalışır.
Endojen Kontrol Lizatı
Bir rekombinant protein numunesi inceliyorsanız, bir endojen kontrolü dahil etmenizi tavsiye ediyoruz.
Rekombinant proteinin katlanması, endojen doğal formundan farklı olabilir ve antikorun epitopa erişimini engelleyebilir.
Rekombinant proteinin, kullanıyor olduğunuz antikor için immünojen dizisi içerdiğinden her zaman emin olun. Bir endojen pozitif kontrol, sonuçları doğrulamak için önemlidir ve reaktiflerin (örn. antikorlar) ne kadar iyi olduğunu ve protokolün çalışıyor olduğunu gösterir.
Rekombinant Protein ve Aşırı Ekspresyon Lizatı Antikor Kontrolü
Rekombinant veya aşırı ekspre edilmiş proteinleri doğrulamak için bir anti-Tag antikoru kullanmanızı tavsiye ediyoruz. Ek olarak, mRNA seviyelerinin değerlendirilmesi de protein aşırı eskpresyonunu doğrulamak için desteklenmektedir. İmmünojen, protein etiketiyle aynı uca yerleştiğinde dikkatli olun; çünkü etiket potansiyel olarak, antikorunuzun tanıdığı epitopu bloke edebilir.
Rekombinant veya aşırı ekspre edilmiş proteinin, kullanıyor olduğunuz antikor için immünojen dizisi içerdiğinden her zaman emin olun.
Primer Antikor Kontrolünün Olmaması
Bu, sadece bir sekonder antikor eklediğinizde olur. Bu kontrol, sekonder antikorun spesifik olmayan bağlanmasının meydana geldiğini gösterebilir. Bu, çoklu bir western blotu optimize ettiğinizde oldukça önemli bir adımdır; çünkü sekonder antikorların birbirlerine müdahale etmediğini ve hedef dışı bağlanmanın meydana gelmediğini doğrular.
Antikor içermeyen antikor dilüsyon tamponu, prosedürün bu noktasında, primer antikor solüsyonu yerine kullanılır. Sekonder antikor, her zaman olduğu gibi aynı şekilde, numune üzerinde inkübe edilir.
Floresan Western Blot İçin Alexa Fluor® Etiketli Yükleme Kontrolleri
Floresan western blotın gelmesiyle, çoklu proteinler artık, farklı floroforlar kullanarak aynı anda analiz edilebiliyor. Bu gelişen tekniğin, Western blottaki standart kemilüminesans tespit yöntemleri ile karşılaştırıldığında, gelişmiş doğrusallık ve artan tekrarlanabilirlik sağladığı kanıtlanmıştır.
Floresan western blot, görünür ışık aralığında membran otofloresan ihtimalini engellemek için, yakın kızılötesi spektrumunda en uygun biçimde çalışır.
Bu nedenle, bu teknik, Alexa Fluor® 680 ve Alexa Fluor® 790 gibi parlak ve sabit yakın kızılötesi boyaları gerektirir.
Hedef | Alexa Fluor® 680 | Alexa Fluor® 790 |
beta Aktin | ||
alfa Tübülin | ||
GAPDH |
Alexa Fluor®, Life Technologies’in tescilli ticari markasıdır. Alexa Fluor® boya konjugatları, Life Technologies tarafından Abcam’e lisansı verilen teknolojiyi içermektedir.
