Western blot nedir?
“Western blot” veya “western blotting”, karmaşık bir karışım içindeki spesifik proteinleri ayırmak ve tanımlamak için araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Western blot, numuneler arasındaki göreceli protein seviyelerini belirlememize ve hedefin moleküler ağırlığını saptamamıza olanak tanır; bu da proteinin translasyon sonrası işlenmesi hakkında fikir verebilir. Bunu başarmak için western blot üç aşama uygular: (1) boyuta göre ayırma, (2) katı bir desteğe aktarma ve (3) primer ve sekonder antikorlar kullanarak hedef proteini görüntüleme.
İlk adımda proteinler, jel elektroforezi ile boyutlarına göre ayrılır (Şekil 1). Ardından jel, membran ile temas edecek şekilde yerleştirilir ve bir elektrik akımı kullanılarak proteinlerin jelden membrana göç etmesi sağlanır. Proteinlerin membrana aktarılması gereklidir; çünkü elektroforez için kullanılan jeller immün boyama için elverişsiz bir yüzey sunar, yani antikorlar jeldeki proteinlere yapışmaz. Membran, ilgili hedefe özgü antikorlarla daha ileri işlemlere tabi tutulabilir ve enzim bağlı veya florofor konjuge sekonder antikorlar ve tespit reaktifleri kullanılarak görüntülenebilir.
- Proteinler, jel elektrofezleri kullanılarak boyutlarına göre ayrılır.
2. Proteinler membrana aktarılır.
3. Membran üzerindeki protein bantlarının primer ve sekonder antikorlarla immün boyanması
4. İmmün boyamanın görüntülenmesi (floresan WB görüntüsü örneği)
Şekil 1. Western blotun basitleştirilmiş bir şeması.
Western blot için antikor seçimi
Western blotunuzun hassasiyeti ve özgüllüğü, antikorların kalitesine ve kullanıldıkları deneysel koşullara bağlıdır. Serum içeren ve dolayısıyla endojen immünoglobulinler barındıran doku lizatları veya doku kültürü süpernatantları ile çalışırken, numune türünüzden farklı bir türde üretilmiş bir primer antikor seçmelisiniz. Örneğin, bir fare proteinini inceliyorsanız, fare dışındaki bir türde üretilmiş bir primer antikor (örneğin tavşanda üretilmiş primer antikor) seçin. Bu, sekonder anti-immünoglobulin antikorun numunedeki endojen immünoglobulinlerle çapraz reaksiyona girmesini önlemek içindir. Endojen immünoglobulin içermeyen numuneler kullanıldığında, primer antikorun üretildiği konak tür seçimi daha az kritiktir.
Mümkün olduğunda, hedeflenen bölgeye spesifik olarak bağlandığından emin olmak için nakavt (KO) doğrulaması yapılmış bir primer antikor seçin.
Proteininizi görüntülemek için, primer antikora bağlanacak (primer antikorun üretildiği konak türe karşı) bir sekonder antikor seçin. Horseradish peroksidaz (HRP) veya alkalin fosfataz (AP) konjugat antikoru gibi enzim bağlı bir sekonder antikor ya da western blot için optimize edilmiş bir floresan konjugatlı sekonder antikor kullanmak, yüksek düzeyde hassasiyet sağlar. Floresan konjugat kullanıyorsanız, floresan boyanın ışık emisyon dalga boyunun okuma cihazınızla/tarayıcınızla uyumlu olup olmadığını kontrol etmeyi unutmayın.
Yalnızca primer antikor kullanımına kıyasla, konjuge sekonder antikorların artan hassasiyeti, bu antikorların primer antikora birden fazla noktadan bağlanarak sinyali yükseltmesinden kaynaklanır. Bu nedenle, sekonder antikor kullanımı western blot için idealdir; çünkü sağladıkları sinyal amplifikasyonu, karmaşık bir protein karışımı içindeki ilgili proteinin daha kolay tespit edilmesine olanak tanır.
Bir western blot’ta doğrudan konjuge primer antikorlar (örneğin HRP konjugatları) kullanmak, sekonder antikor adımına olan ihtiyacı ortadan kaldırarak protokolü hızlandırmanızı ve basitleştirmenizi sağlar. Primer antikor konjugatlarını seçerken antikor özgüllüğüne dikkat edin. İdeal olarak, yüksek özgüllük ve partiler arası tutarlılık sağlayan rekombinant monoklonal antikorları tercih edin.
Sekonder antikorlarla karşılaştırıldığında, primer konjugatlar sinyal amplifikasyonu sağlamaz; bu nedenle ilgili proteininiz numunede bol miktarda bulunmalıdır. Abcam, western blot için uygun, doğrudan HRP’ye konjuge edilmiş geniş bir primer rekombinant antikor yelpazesi sunmaktadır. Seçtiğiniz antikor uygun bir konjuge formatta mevcut değilse, Abcam’ın antikor konjugasyon kitlerini kullanarak primer antikoru kolaylıkla HRP konjuge hale getirebilirsiniz.
Abcam antikor konjugasyon kitlerini incelemek için buraya ve buraya tıklayın.
Western blot doğrudan ve dolaylı etiketleme
Bir Western blot deneyi yürütmeden önce, hedef proteini derinlemesine araştırmak son derece önemlidir. Prosedür hakkında daha fazla bilgi edinmek için Western blot protokolümüze başvurabilirsiniz.
- Geleneksel bir Western blot’ta (dolaylı etiketleme), protein numuneleri önce SDS-PAGE ile ayrıştırılır ve ardından elektroforetik olarak membrana aktarılır.
- Bloklama adımından sonra membran, söz konusu antijene karşı geliştirilmiş bir primer antikor ile incelenir.
- Yıkama adımını takiben membran, genellikle primer antikora karşı yönlendirilmiş, enzim konjuge bir sekonder antikor ile inkübe edilir. Floresan saptama durumunda ise bunun yerine florofor konjuge bir sekonder antikor kullanılır.
― Sinyal üretimi için boyanın floresanı veya alkalin fosfataz (AP), glukoz oksidaz (GO) veya horseradish peroksidaz (HRP) gibi enzimin aktivitesi gereklidir.
- Son olarak membran tekrar yıkanır ve uygun bir enzim substratı ile (eğer gerekliyse) inkübe edilerek raporlanabilir bir sinyal üretilir.
― Doğrudan etiketleme analizi, konjuge primer antikorlar (örneğin HRP-konjuge) kullanır; bu da sekonder antikor adımına olan ihtiyacı ortadan kaldırarak prosedürü basitleştirir, protokolü kısaltır ve sonuç alma süresini hızlandırır.
Western blot prosedürü hakkında daha fazla bilgi için talebe yönelik yapılan Western blot webinarımızı izleyebilirsiniz.
İmmün blot saptama
Western blot işleminde tercih edilebilecek birkaç farklı okuma seçeneği mevcuttur. Her birinin, ihtiyaçlarınıza ve laboratuvarınızdaki mevcut ekipmanlara bağlı olarak avantajları ve dezavantajları bulunmaktadır.
Kolorimetrik western blotting
Şekil 2. Kolorimetrik western blot tespitinin şematik gösterimi. Sol panel dolaylı saptamayı gösterirken, sağ panel ise doğrudan saptamayı göstermektedir.
Kolorimetrik saptama, uygun bir enzimin kromojenik bir blotting substratını dönüştürmesiyle oluşan ve western blot üzerinde tortulaşmış halde olan renkli bir ürünün üretilmesine dayanır. Kromojenik substratların sınırlı hassasiyeti, düşük bolluğa sahip proteinleri saptamak için bu substratların optimize edilmesini zorlaştırabilir. Bununla birlikte, arka plan sinyalinin eş zamanlı olarak gelişmesine olanak sağlamak için kromojenik reaksiyonun birkaç saat (hatta gece boyunca) sürmesine izin verilebilir.
Buna karşılık, reaksiyon görsel olarak izlenebildiği ve durdurulmadan önce yeterli renk gelişimi gerçekleşene kadar ilerlemesine izin verilebildiği için kolorimetrik substratlar, bol bulunan proteinleri saptamak için mükemmeldir. Renkli çökeltiyi görselleştirmek için özel bir ekipman gerekmez ve üretilen sinyal oldukça stabildir.
Florometrik western blotting
Şekil 3. Floresan western blot tespitinin şematik gösterimi.
Florometrik saptama, bir florofor ile etiketlenmiş bir antikorun kullanılmasını gerektirir. Floroforu uyarmak için bir ışık kaynağı kullanılır ve florofor temel durumuna dönerken geçici bir ışık emisyonu üretir. Işık, uyarma için kullanılandan daha yüksek bir dalga boyunda yayılır ve florimetre taraması yapan özelleşmiş bir okuyucu ile saptanır.
Kemilüminesans western blotting
Şekil 4. Floresan western blot tespitinin şematik gösterimi.
Kemilüminesans, bir substratın bir enzim tarafından katalize edilmesi ve reaksiyonun bir yan ürünü olarak ışık üretmesiyle meydana gelir. Reaksiyondaki sınırlayıcı bileşen substrattır; substrat tükendikçe ışık üretimi azalır ve sonunda durur. Bununla birlikte, iyi optimize edilmiş bir prosedür, birkaç saat boyunca kararlı bir ışık çıkışı sağlayarak tutarlı ve hassas protein tespitine olanak tanımalıdır.
Işık sinyalini görselleştirmek için, röntgen filmleriyle çalışıyorsanız bir banyo makinesi veya röntgen filmi gerektirmeyen bir western blot kamera cihazı kullanabilirsiniz.
