Nekroptoz, piroptoz ve ferroptozun nasıl tanımlandığını öğrenin
Farklı apoptotik olmayan hücre ölümü biçimlerini ayırt etmek, özellikle benzer morfolojik özellikleri paylaştığı için zor olabilir. Bununla birlikte, her biriyle ilgili farklı düzenleyici yollar, tespit edilmeleri için kullanılabilecek farklı protein belirteçleri sağlar.
Hangi hücre ölümü modu çalışıyorsanız çalışın, farklı yaklaşımların bir kombinasyonu kullanılmalıdır. Apoptotik olmayan hücre ölümü çalışmalarında, apoptozun ekarte edilmesi için diğer hücre canlılık deneyleri ve teknikleriyle birlikte, ilgili hücre ölümü modu için spesifik pozitif göstergeler kullanılmalıdır.
Nekroptozis saptanması
Nekroptoz, tümör nekroz faktörü reseptörü 1 (TNFR1) 2 dahil olmak üzere ölüm reseptörlerine bağlanan bir ligand ile başlatılır. Nekroptotik yolda birçok protein yer almasına rağmen, nekroptozu saptamada en güvenilir yöntem, MLKL fosforilasyon durumunun ölçülmesi ve nekroptotik yolun spesifik inhibisyonudur.
MLKL fosforilasyonu
MLKL, RIPK3 aracılı fosforilasyon ile aktive edilir. MLKL’nin aktivasyon durumu, Thr357 ve Ser358’in fosforilasyon durumu ölçülerek belirlenebilir. Fosfo-MLKL, western blot, IHC ve flow sitometri dahil olmak üzere antikor bazlı yöntemler ile tespit edilir.
Nekroptoz inhibisyonu
Nekroptotik yolun bileşenlerini hedefleme – kimyasal inhibisyonla veya transgenik modellerle – hücre ölümünün nekroptoza bağlı olup olmadığını anlamak için kullanılabilir.
İnhibitörleri kullanırken dikkat edilmesi gerekenler:
Nec 1’in hedef dışı bir etkinliği vardır; Nec1’ler daha spesifiktir.
RIPK1 apoptoza7 katkıda bulunabilir. RIPK1 inhibitörlerinin bazı durumlarda apoptozu da engelleyebileceğini unutmayın.
Nekroptoz varlığını doğrulamak için transgenik modellerin kullanılması en iyi yöntemdir.
Piroptozis saptanması
Piroptozis, mikrobiyal enfeksiyona cevap olarak ortaya çıkan, programlanmış nekrozun inflamatuar kaspazına bağlı bir şeklidir. Morfolojik olarak, piroptotik hücreler, hücre şişmesi ve hızlı plazma zarı lizizini gösterir. Piroptoz, kaspaz aktivasyonuna, gasdermin D bölünmesine bakarak ya da pirototik yolağın temel bileşenlerini inhibe ederek ya da azaltarak incelenebilir.
Kaspaz aktivitesi
Aktif kaspazlar, piroptozis sırasında aktif olmayan kaspaz formlarından ayrılır. Kaspaz bölünmesi, spesifik bir kaspaz antikoru kullanılarak western blot ile tespit edilebilir.
Aktif kaspazlar bölünmüş olmasına rağmen, tek başına kaspaz bölünmesinin gözlemlenmesi kaspaz aktivasyonunun kanıtı değildir ve piroptozu doğrulamak için başka yöntemler de kullanılmalıdır. Kaspaz aktivasyonu, doğrudan kaspaz aktivasyon deneyleri kullanılarak tespit edilebilir.
Gasdermin
Piroptoz, gasdermin D’nin (53 kDa) parçalanmasını içerir, bu da western blot tarafından tespit edilen 30 kDa N-terminal parçası ile sonuçlanır.
Gasdermin D’nin N-terminal bölgesini tespit eden anti-gasdermin D tavşan poliklonalini (ab155233) kullanmanızı öneririz.
Piroptoz inhibisyonu
Kaspaz 1, 11, 4 veya 5’e bağımlılığın gösterilmesi, piroptotik hücre ölümünün diğer nekroptoz ve apoptoz formlarından ayırt edilmesi için esastır. Hücre ölümünün hala bu kaspazların ablasyonundan sonra mı, kimyasal inhibisyonla mı yoksa transgenik modeller kullanılarak mı yapıldığını belirleyin.
Kaspaz 1 aktivitesi, z-YVAD-fmk (ab141388) ile kimyasal inhibisyonla giderilebilir.
Ferroptozis tespiti
Ferroptoz, lipid reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin bir sonucu olarak ortaya çıkan demir bağımlı bir hücre ölümü şeklidir. Ferroptoz geçiren hücreler, artan yoğunluklu normalden daha küçük mitokondri dahil olmak üzere ince morfolojik özellikler gösterir. Ferroptoz varlığı, hücre ölümünün inhibitörler tarafından önlenip önlenmediğine bakarak ve lipit peroksitleri ölçerek doğrulanabilir.
Ferroptozu önleme
Ferroptoz varlığı, ferroptozu önlediği bilinen kimyasal inhibitörler kullanılarak doğrulanabilir. Ferroptoz GPX4 aktivitesinin azalmasından kaynaklandığı için, yıkım etkili bir yöntem değildir.
Lipid peroksitlerin birikimi
Ferroptoz, lipit reaktif oksijen türlerinin (ROS) birikimine bağlıdır. Lipit ROS’un varlığını tespit etmek için bir takım yöntemler mevcuttur.
