Metabolik, sitotoksisite, hücre proliferasyonu ve hücre döngüsü analizlerinin tümü hücre canlılığını ölçmek için kullanılabilir.
Kısaca hücre canlılığı, bir numunedeki canlı ve sağlıklı hücre sayısıdır2. Kontrol grubunun yüzdesi olarak hesaplandığında, %80-95 hücre canlılığı sağlıklı bir kültüre işaret eder. Süspansiyon kültürlerinde, tripsinizasyon sırasında ölü hücreler yıkanıp uzaklaştırılamadığı için bu sayı biraz daha düşük olabilir.
Hücre canlılığı analizlerine genel bakış
Aşağıdaki analizler hücre canlılığını ölçmek için kullanılabilir:
- Metabolik analizler
- Sitotoksisite analizleri
- Hücre proliferasyonu ve hücre döngüsü analizleri
Bu analizler, hücre sağlığının bir göstergesi olarak metabolik aktiviteye, ATP içeriğine veya hücre proliferasyonuna dayalıdır. Membran bütünlüğü kaybı ve diğer hücre hasarı veya ölümü markerları, dolaylı olarak hücre canlılığını ölçmek için kullanılabilir.
Bu analiz yöntemleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için aşağıya bakabilirsiniz veya en yaygın kullanılan analiz kitlerimizi buradan inceleyebilirsiniz:
- Hücre canlılığı analizleri: MTS, resazurin, TMRE, calcein violet, ve ATP luminescence.
- Sitotoksisite analizleri: LDH analiz, DRAQ7®, ve combined dye live:dead cell assayimiz.
- Hücre proliferasyonu ve hücre döngüsü analizleri: EdU, propidium iodide, ve CFSE.
Bir canlılık analizi ile bir sitotoksisite analizi arasındaki fark nedir?
Metabolik analizler, sitotoksisite analizleri, hücre proliferasyonu ve hücre döngüsü analizlerinin tümü canlılığı değerlendirmek için kullanılabilse de her biri farklı bakış açıları sunar.
Hücre canlılığı analizleri, metabolizma, DNA sentezi ve hücre bölünmesi gibi sağlıklı hücre fonksiyonlarının markerlarını tanımlar. Bunlar canlı hücre sayısını ölçmek için kullanılmakla birlikte, metabolik aktivite ve sağlıklı fonksiyon seviyesinin azalıp azalmadığını gösterebildikleri için sitotoksisitenin bir göstergesi olarak da kullanılabilirler. Canlılık analizleri, bir numunedeki yalnızca geriye kalan canlı hücre sayısını söyler ve bu sayının sitotoksik mi yoksa antiproliferatif etkilerin bir sonucu mu olduğunu belirtmez.
Buna karşılık, sitotoksisite analizleri, membran bütünlüğünün kaybı gibi ciddi hücre hasarı markerlarını tespit ederek bir kimyasalın hücreler üzerindeki toksisitesini ölçer. Hücre canlılığını dolaylı olarak ölçmek için sitotoksisite analizlerini kullanmak mümkündür.
Hücrelerinizde neler olup bittiğine dair daha eksiksiz bir tablo arıyorsanız, bir canlılık analizini bir sitotoksik analiz ile birleştirmek iyi bir çözüm olabilir.
Metabolik analizler
Metabolizma, biyolojinin merkezinde yer alan karmaşık bir süreçtir. Metabolizmadaki değişiklikler, kanserden nörodejenerasyona kadar son derece geniş bir yelpazedeki sonuçlarla ilişkilidir.
Hücre içinde metabolizma, enerji üreten ve yaşamı sürdüren birden fazla enzimatik reaksiyonu kapsar. Bu süreçleri ölçmek, ister gelecekteki deneyleri şekillendirmek ister hastalık seyrini değerlendirmek için olsun, araştırmaların kritik bir parçası olabilir.
Metabolik analizler, metabolizmada bulunan enzimlerin ve proteinlerin varlığını belirleyerek hücre canlılığını gösterir. Proliferasyona uğrayan hücrelerin metabolik hızları artar3; bu nedenle metabolik analizler proliferasyonu değerlendirmek için de kullanılabilir.
Metabolik bir analiz seçerken dikkat edilmesi gereken faktörler şunlardır:
- Analiz hassasiyeti
- Sinyal-gürültü oranı
- Kullanım kolaylığı
- Reaktif stabilitesi4
Genellikle lüminesans tabanlı analizler, floresan veya absorbans tabanlı analizlere göre daha hassastır.
Metabolizma analizleri, canlılığı değerlendirmenin yanı sıra metabolitleri ve metabolik enzimleri ölçmek gibi diğer amaçlar için de kullanılır. Metabolizma ölçüm kılavuzumuza göz atın.
Boya indirgeme analizleri
Boya indirgeme analizleri genel olarak tetrazolyum analizleri ve resazurin analizleri olarak ikiye ayrılır. Bu analizlerde, bir popülasyondaki canlı hücre oranını belirlemek için bir reaktif, hücre numunesi ile inkübe edilir. Reaktif içindeki bileşikler, metabolik olarak aktif bir ortamda bir boya oluşturur ve meydana gelen renk değişimi, hücre canlılığının derecesini göstermek üzere belirlenebilir (bkz. Şekil 1).
Şekil 1. Boya indirgeme analizine genel bakış.
Tetrazolyum analizleri
Tetrazolyum hücre canlılığı analizleri, absorbans ile ölçülen renkli bir formazan ürünü oluşturmak için hücresel dehidrojenazlara dayanır.
En yaygın kullanılan tetrazolyum analizleri iki gruba ayrılır:
- MTT analizi – hücrelere kolayca nüfuz eden, pozitif yüklü bir tetrazolyum tuzu.
- MTS, XTT ve WST-1 analizleri – hücrelere kolayca nüfuz edemeyen, negatif yüklü tetrazolyum tuzları5.
MTT analizi
MTT analizi, tritiyumlu timin katılım analizine radyoaktif olmayan bir alternatif sağlamak amacıyla geliştirilmiştir. Ancak MTT analizi, hücre proliferasyonunun değil, hücre canlılığının bir ölçüsüdür.
MTT, hücre içindeki NADH ve NADPH gibi substratlarla gerçekleşen bir elektron transfer reaksiyonu aracılığıyla formazana dönüştürülür (Şekil 2). Ancak meydana gelen formazan kristalleri çözünmez yapıdadır ve hücrelerin içerisinde ve kültür ortamında çökelti oluşturur. Renk değişiminin spektrofotometre ile tespit edilebilmesi için bu kristallerin çözündürülmesi gerekir. Formazan kristalleri çözmek için DMSO ve SDS gibi solüsyonlar kullanılabilir; fakat bu durum, MTT’nin toksik yapısıyla birleştiğinde, MTT analizinin bir sonlanım noktası analizi olarak kullanılmasını zorunlu kılar. MTT ayrıca ışığa karşı duyarlıdır, bu nedenle karanlıkta saklanmalı ve kullanılmalıdır.
Avantajları:
- Basit
- Kullanımı kolay
- Yaygın olarak kullanılır
Dezavantajları:
- Toksisite
- Kimyasal müdahalelere açık olması
- Floresan ve lüminesan temelli hücre canlılığı analizlerine göre daha az hassas olması
Şekil 2. Metabolik olarak aktif hücrelerde, MTT’nin indirgenerek çözünmeyen formazan oluşturması.
MTS, XTT ve WST-1 analizleri
MTS, XTT ve WST-1 analizleri, kültür ortamında çözünebilen ürünler üretir. Bu durum çözündürme basamağını ortadan kaldırsa da, bu tetrazolyum tuzları hücre membranlarına kolayca nüfuz edemez. Bu nedenle, bir aracı elektron akseptör reaktife ihtiyaç duyulur. Bu aracı reaktif hücreye girer, kendisi indirgenir ve ardından hücreden çıkarak elektronları tetrazolyum tuzuna aktarabilir. Tuz daha sonra çözünür bir formazan ürününe dönüştürülür (Şekil 3). Ancak aracı reaktif, hücreler için toksik olabileceğinden, reaksiyonun numunenize ve analiz koşullarınıza göre optimize edilmesi önemlidir.
Ürün çözünür olduğu için, aynı plakadan belirli zaman aralıklarıyla birden fazla okuma alınabilir; yine de 4 saatten uzun inkübasyonlardan kaçınılmalıdır. Ek olarak, MTS, XTT ve WST-1 analizlerinin arka plan okumaları genellikle MTT analizlerine göre daha yüksektir (sırasıyla 0.3 ve 0.05 absorbans okumaları). Ancak bu okumalar kültür ortamına ve pH’a bağlıdır.
Avantajları:
- Kullanımı kolay
- DMSO ile çözündürme gerektirmez
- MTT’ye göre daha hassas ve daha kesin sonuç verir (WST-1 en hassas olanıdır)
Dezavantajları:
- Aracı reaktif gerektirir
Şekil 3. Aracı elektron alıcı fenazin etil sülfat (PES) aracılığıyla MTS’nin indirgenerek çözünür formazan oluşturması.
Assay | Araç | Açıklamalar |
MTT | Plaka okuyucu | Orijinal tetrazolyum analizidir; hâlâ çok popülerdir. Yıkama / çözündürme basamağı gerektiren tek tetrazolyum analizidir. |
MTS | Plaka okuyucu | En popüler analizdir. WST-1’e kıyasla daha yoğun kullanılır. |
WST-1 | Plaka okuyucu | MTT, XTT veya MTS’den daha hassastır. |
Cell Counting Kit-8/CCK-8/WST- 8 | Plaka okuyucu | – |
XTT assay | Plaka okuyucu | – |
Rezazurin analizleri
Diğer boya indirgeme testlerinde (analizlerinde) olduğu gibi, uzun inkübasyon süreleri önerilmez ve duyarlılık ile toksisiteyi dengeleyecek şekilde optimize edilmelidir.
Rezazurin analizleri, tetrazolyum analizleriyle aynı prensibe dayanır ve bir bileşiği diğerine dönüştürmek için elektron transferini kullanır (Şekil 4). Bu yöntemde, fizyolojik tamponlarda çözündüğünde koyu mavi bir solüsyon oluşturan rezazurin, rezorufine dönüştürülür.
Rezorufin pembe renkli, floresan bir üründür. Floresan genellikle absorbans ölçümlerine göre daha hassas olduğundan, bu durum tetrazolyum analizlerine karşı bir avantaj sağlar. Ek olarak rezazurin hücrelere nüfuz edebilir; bu da bir aracı elektron akseptörünün gerekli olmadığı anlamına gelir, ancak sisteme dahil edilmesi sinyal oluşumunu hızlandırabilir.
Rezazurin analizleri nispeten ucuzdur ve sitotoksisite mekanizmalarının daha iyi anlaşılması için diğer yöntemlerle kombine edilerek kullanılabilir. Bu avantajlara rağmen, diğer bileşiklerden kaynaklanabilecek floresan müdahalelerini önlemek için dikkat edilmelidir.
Diğer boya indirgeme analizlerinde olduğu gibi, uzun inkübasyon süreleri önerilmemekle birlikte hassasiyet ve toksisiteyi dengelemek için süre optimize edilmelidir.
Şekil 4. Canlı hücrelerde rezazurinin rezorufine indirgenmesi.
Avantajları:
- Nispeten ucuz
- Tetrazolyum analizlerine kıyasla daha yüksek hassasiyet
Dezavantajları:
- Diğer bileşiklerden kaynaklanan floresan müdahalesi riski
Assay | Araç | Açıklamalar |
Rezazurin | Plaka okuyucu, mikroskop, flow sitometri | Florometrik (Ex/Em 535–560/560–615) veya kolorimetrik. Yıkama gerektirmeyen analizdir. Floresan okuma, diğer analizlerle çoklu (multipleks) çalışmaya olanak tanır. |
Şekil 5. İdarubisin (solda) veya staurosorporin (sağda) ile işlem görmüş ve Rezazurin analizi (ab129732) ile analiz edilmiş Jurkat hücreleri.
Mitokondriyal membran potansiyeline bağımlı boyalar
Membran potansiyeli, bir hücrenin ATP üretme yeteneği ile yakından ilişkilidir ve bu nedenle hücre sağlığının bir göstergesi olarak kullanılabilir. Mitokondriyal membran potansiyeli nedeniyle mitokondride biriken ve canlı hücreleri tanımlamak için kullanabileceğiniz birkaç boya mevcuttur.
Membran potansiyelinin kaybı ve boyanmanın ortadan kalkması, apoptozu analiz etmek için kullanılır.
Avantajları:
- TMRE tersinirdir ve canlı hücre analizleri için uygundur
- JC-1 ve JC-10 karşılaştırmalı ölçümler için idealdir
Dezavantajları:
- Bazı analizler sabitlenmiş (fikse edilmiş) numuneler için uygun değildir
- Performansın doğruluğundan emin olmak için kontroller ve teknik detaylar dikkatli bir takip gerektirir6
Assay | Araç | Açıklamalar |
TMRE/TMRM | Plaka okuyucu, mikroskop, flow sitometri | En popüler Abcam mitokondriyal membran boyası analizidir. Ex/Em 549/575 nm. Fiksasyondan sonra mitokondriden yıkanarak uzaklaştırılır. |
JC-1/JC-10 | Plaka okuyucu, mikroskop, flow sitometri | JC-1 (Ex/Em 530/530–570) ve JC-10 (Ex/Em 590/520–570) yüksek konsantrasyonlarda kırmızı agregatlar oluşturur (agrege olmamış boya yeşildir). Membran potansiyeli kaybı, boya kaybına ve yeşil floresanın artmasına neden olur. JC-10, JC-1’den daha çözünürdür. En çok sonlanım noktası analizi için uygundur. Fiksasyondan sonra yıkanarak uzaklaştırılır. |
Mitotracker Red | Plaka okuyucu, mikroskop, flow sitometri | Ex/Em 579/599. Fiksasyondan sonra yıkanarak uzaklaşmaz. |
Rhodamine 123 | Plaka okuyucu, mikroskop, flow sitometri | Ex/Em 507/529. Fiksasyondan sonra yıkanarak uzaklaşır. |
MitoNIR | Plaka okuyucu, mikroskop, flow sitometri | Ex/Em 635/660. |
MitoOrange | Plaka okuyucu, flow sitometri | Ex/Em 540/590. |
Şekil 6. TMRE kiti (ab113852) ile hücre boyama. A: (solda): Sağlıklı HeLa hücreleri. B (sağda): Sağlıklı Jurkat hücreleri.
Esteraz cleavage
Kalsein ve benzeri hidrofobik boyalar hücrelerin içine difüze olur ve canlı hücrelerdeki hücre içi esterazlar tarafından bölünür; bu durum, metabolik sağlık ve membran bütünlüğünün bir göstergesi olan enzimatik aktivitenin ölçülmesini sağlar. Hidrofilik floresan ürün hücre içinde tutulur.
Avantajları:
- Toksik değildir
Dezavantajları:
- Diğer bileşiklerden kaynaklanabilecek potansiyel floresan müdahalesi
Assay | Araç | Açıklamalar |
Calcein AM | Plaka okuyucu, mikroskop, flow sitometri | Ex/Em 495/515 nm |
Calcein violet AM | Plaka okuyucu, mikroskop, flow sitometri | Ex/Em 405/460 nm |
Esterase-cleaved blue | Plaka okuyucu | Ex/Em 405/460, 360/450 nm |
Esterase-cleaved green | Plaka okuyucu, mikroskop | Ex/Em 490/520 nm |
ATP analizleri
Çoğu analiz, ATP’yi açığa çıkarmak için bir hücre membranını geçirgen hale getirme maddesi kullanır; ışık, ATP-bağımlı lusiferaz kullanılarak üretilir. Diğer ATP analizleri, ATP-bağımlı gliserol fosforilasyonunu (ya da diğer substratları) kullanır.
Avantajları:
- Hassas
- Hızlı
Dezavantajları:
- Hücre lizisi gerektirir
Assay | Araç | Açıklamalar |
Luminescence ATP assay | Lüminometrik plaka okuyucu | Yıkama gerektirmeyen analiz. |
Luminescence ADP/ATP assay | Lüminometrik plaka okuyucu | Yıkama gerektirmeyen analiz. ATP analizinden sonra, tespit için ADP ATP’ye dönüştürülür. |
ATP phosphorylation assay | Plaka okuyucu | Hücre lizatları ile kullanılan, yıkama gerektirmeyen analiz. Lüminesan analizleri kadar hassas değildir. Florometrik yöntem (Ex/Em 535/587 nm), kolorimetrik yönteme göre daha hassastır. |
Oksijen tüketimi ve glikoz analizleri
Oksijen tüketim hızı, hücresel metabolik aktivitenin seviyesini gösterir. Hücre içi oksijen seviyelerinin ve glikoliz aktivitesinin analizi, hücre sağlığının daha derinlemesine incelenmesine olanak tanır.
Avantajları:
- Hücreye zarar vermez ve tamamen tersinirdir; böylece zamana bağlı analizlere ve ilaç uygulamalarına olanak tanır.
- Analizler özel bir ekipman veya prob gerektirmez; sinyal, standart bir floresan veya TR-F plaka okuyucuda ölçülür.
- İzole mitokondriler, hücre kültürleri, dokular, enzim preparatları ve küçük organizmalar ile kullanılabilir.
Dezavantajları:
- İnkübatördeki atmosferik koşulların değiştirilmesini gerektirebilir.
Assay | Araç | Açıklamalar |
Hücre dışı oksijen tüketimi | Plaka okuyucu | Yıkama gerektirmeyen analiz. Solunum O2 seviyelerini düşürdükçe boya sinyali (Ex/Em 380/650 nm) artar. Özel bir cihaza gerek yoktur. |
Hücre içi oksijen seviyeleri | Plaka okuyucu | Boya floresanı (Ex/Em 340/642) hücre içi oksijen tarafından sönümlenir. Yıkama gerektirmeyen analizdir. |
Glikoliz aktivitesi | Plaka okuyucu | Yıkama gerektirmeyen analiz. Laktat üretimi hücre dışı asitlenmeye ve boya floresanının (Ex/Em 340-380/615 nm) artmasına neden olur. |
Sitotoksisite analizleri
Sitotoksisite, bir maddenin bir hücre için ne kadar toksik olduğunun bir ölçüsüdür. Toksik bir maddeye yanıt olarak hücrenin proliferasyonu durabilir veya hücre apoptoz ya da nekroz nedeniyle ölebilir.
Sitotoksisite analizleri, ilaç taramalarında bir bileşiğin olası sitotoksik etkilerini taramak için yaygın olarak kullanılır. Kimyasal bir ajanın toksisitesini belirlemek amacıyla bu analizler, ciddi hücresel hasarın veya hücre ölümünün markerlarını (en yaygın olarak da hücre membranı hasarını) tespit eder.
Hücre membranı hasarını değerlendiren yöntemler şunları içerir:
- Hücre dışı ortama sızan enzimlerin aktivitesinin ölçülmesi.
- Canlı hücrelerin yüzeyine zayıf bir şekilde bağlanan ve ölü hücrelerde daha parlak bir boyanma oluşturan amin-reaktif boyalar.
- Membran hasarı üzerine hücreye giren ve hücreyi boyayan membranın geçirmediği boyalar. Bu boyalar, kombine canlı:ölü hücre analizlerinde genellikle canlı hücreleri boyayan boyalarla birlikte kullanılır.
Sitotoksik ajanlar, hücre membranı hasarına yol açmanın yanı sıra protein sentezini durdurarak, reseptörlere geri dönülemez bir şekilde bağlanarak veya başka yapı ya da fonksiyon kayıplarına neden olarak da hücreleri etkileyebilir.
Hücre membranı hasarını değerlendiren yöntemlere alternatif olarak, floresan Sulforhodamine B boyasının bağlanma düzeyini canlı hücre sayısının bir göstergesi olarak kullanan SRB analizi yer alır. Crystal violet analizi de benzer şekilde çalışır. Her iki yöntem de bitişik hücre kültürleriyle kullanılmalıdır; çünkü hücre ölümü sırasında bitişik hücrelerin hücre kültürü plakalarından ayrılması prensibine dayanırlar.
Bu analiz yöntemleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için aşağıya bakın veya LDH analizi, DRAQ7® ve combined dye live: dead cell assayimiz dahil en popüler sitotoksisite analiz kitlerimizi inceleyin.
Enzim sızıntısı
Bu analizler, hücre membranı hasarı meydana geldiğinde hücre dışı ortama sızan enzimlerin aktivitesini ölçer. En popüler analiz laktat dehidrojenaz (LDH) analizidir.
Avantajları:
- Hızlı
- Güvenilir
- Hassas
- Sağlıklı hücreler için toksik değildir
- Yüksek verimli uygulamalar için otomatik hale getirilebilir
Dezavantajları:
- Serum dahil olmak üzere diğer bileşiklerden kaynaklanan müdahalelere açıktır (yalnızca LDH için geçerlidir)
Assay | Araç | Açıklamalar |
LDH / Laktat dehidrojenaz | Plaka okuyucu | LDH laktatı oksitler ve renkli veya floresan (Ex/Em 535/587 nm) bir ürün oluşur. |
AK / Adenilat kinaz | Lüsiferaz ışık üretimi yoluyla tespit sağlanarak AK, ADP’yi ATP’ye dönüştürür. AK aktivitesi LDH kadar dayanıklı değildir. |
Şekil 8. Staurosporin veya sikloheksimid uygulanmış HeLa hücreleri, işlem görmemiş hücreler, LDH pozitif kontrolü ve çözünmüş hücrelerle kullanılan LDH analizi.
Membranın geçirmediği boyalar (boya dışlama analizleri)
Bu analizler, hasarlı hücre membranlarına sahip hücreleri boyayan, membranın geçirmediği floresan boyaları (çoğunlukla DNA boyaları) kullanır. Süspansiyon halindeki hücrelerin membran bütünlüğünü belirlemek için basit ve yaygın olarak kullanılan bir yöntem sunarlar7.
Bir zamanlar yaygın olarak kullanılan propidyum iyodür, geniş emisyon spektrumu ve canlı hücrelere bağlanma eğilimi nedeniyle hücre canlılığı analizlerinde yerini büyük ölçüde DRAQ7™ ve 7-AAD’ye bırakmıştır.
Avantajları:
- Basit
- Hızlı
- Düşük hücre sayıları için kullanılabilir
Dezavantajları:
- Tripan mavisi, hücre sayımı gerektirir ve bu nedenle hataya açıktır
Assay | Araç | Açıklamalar |
DRAQ7TM | Flow sitometri, mikroskop | Ex/Em 633 & 647/665–800 nm. DNA boyası. |
7-AAD | Flow sitometri, mikroskop | Ex/Em 488/647 nm. DNA boyası. |
Propidyum İyodür | Flow sitometri, mikroskop | Ex/Em 536/617 nm. DNA boyası. Zamanla hücrelerden sızma yapar. |
Etidyum homodimer-1 | Flow sitometri, mikroskop | Ex/Em 528/617. DNA boyası. |
Tripan mavisi | Mikroskop | Floresan olmayan hücre boyasıdır. Hücre sayımı gerektiren klasik hücre canlılığı analizidir. Zahmetlidir ve manuel hataya açıktır. En çok küçük numune sayıları için uygundur. |
Şekil 9. Hücre ölümünü tetiklemek için staurosporine ile işlem görmüş Jurkat hücrelerinin, DRAQ7™ boyamasını göstermektedir (grafiğin üst yarısı).
Canlı:ölü hücre analizleri için amin-reaktif boyalar
Amin-reaktif boyalar, hücre yüzeyindeki aminlere bağlanarak canlı hücreleri zayıf şekilde boyar ve hücre içi aminlerle reaksiyona girerek membranı hasar görmüş hücreleri güçlü bir şekilde boyar. Ölü ve canlı hücreler floresan seviyesine göre ayırt edilebilir.
Avantajları:
- Doğru sonuç verir
- Ölü ve canlı hücreler arasında net ayrım sağlar
- Fiksasyonla uyumludur – immünofenotiplendirme deneyleri için gerektiği gibi fiksasyon sonrası analize olanak tanır8
Dezavantajları:
- Potansiyel arka plan floresanı
- Bir flow sitometri gerektirir
Assay | Araç | Açıklamalar |
Amin-reaktif boyalar | Flow sitometri | Ex/Em 410/450 nm. Fiksasyonla uyumludur (bu tablodaki tüm boyalar için geçerlidir). |
Amin-reaktif boyalar | Flow sitometri | Ex/Em 408/512 nm |
Amin-reaktif boyalar | Flow sitometri | Ex/Em 398/550 nm |
Amin-reaktif boyalar | Flow sitometri | Ex/Em 353/442 nm |
Amin-reaktif boyalar | Flow sitometri | Ex/Em 498/521 nm |
Amin-reaktif boyalar | Flow sitometri | Ex/Em 547/573 nm |
Amin-reaktif boyalar | Flow sitometri | Ex/Em 583/603 nm |
Amin-reaktif boyalar | Flow sitometri | Ex/Em 649/660 nm |
Boya kombinasyonlu canlı:ölü hücre analizleri
Ölü ve canlı hücreleri ayırt etmek için tek bir canlı:ölü hücre analizinde birden fazla boya kombine edilebilir. Kitler, hücre canlılığının hızlı bir şekilde miktarının belirlenmesine olanak tanır ve genellikle hem proliferasyon gösteren hem de göstermeyen hücreler için uygundur.
Avantajları:
- Hızlı
- Diğer canlılık/sitotoksisite analizlerine göre daha sağlam ve doğrudur
Dezavantajları:
- Potansiyel arka plan floresanı
Assay | Araç | Açıklamalar |
Kombine canlı:ölü hücre boyama analizleri | Flow sitometri veya floresan mikroskopi | Ölü hücreleri etiketlemek için etidyum homodimer ve canlı hücreler için esterazla bölünen bir boya içeren popüler canlı ve ölü hücre analizidir. |
Kombine canlı:ölü hücre boyama analizleri | Mikroplaka analizleri, floresan mikroskobu gibi çeşitli floresan platformlarına kolayca uyarlanabilir | Florometrik dual yeşil/kırmızı analiz; ölü hücreler için kırmızı bir DNA boyama boyası ve canlı hücreler için yeşil bir esterazla bölünen boya içerir. |
Şekil 10. Sol: Canlı (sol üst) ve ölü (sağ alt) hücrelerle kullanılan canlı:ölü hücre analizi (ab115347). Sağ: ab115347 ile boyanmış etoposid ile işlem görmüş hücreler. Canlı hücreler yeşil, ölü hücreler kırmızı boyanır.
Hücre proliferasyonu ve hücre döngüsü analizleri
Proliferasyon, hücrelerin genellikle hücre döngüsünün evreleri (mitoz) yoluyla sayısını artırma sürecidir. Organizmalarda gelişim ve boyutsal erişim için temel olmasının yanı sıra, proliferatif mekanizmaların işlev bozukluğu kanser gibi hastalıklara yol açabilir9.
Hücre proliferasyonu analizleri, bir popülasyonda aktif olarak bölünen hücrelerin sayısını ölçerken4, canlılık analizleri ise pasif veya yaşlanmış da olabilen tüm canlı hücreleri ölçer. Proliferasyon analizleri ek olarak hücre canlılığının bir göstergesini de sağlayabilir, çünkü sadece canlı hücreler çoğalabilir. Bölünen hücrelerin sayısı, DNA seviyeleri, DNA sentezi, metabolik aktivite veya proliferasyona özgü proteinler analiz edilerek ölçülebilir.
Proliferasyon, kanserde prognozun bir göstergesi olarak kullanılabilir; yüksek proliferasyon oranı agresif kanserlerle ilişkilidir. Bu nedenle proliferasyon analizleri, Ki67, proliferasyon gösteren hücre nükleer antijeni (PCNA) ve minikromozom sürdürme (MCM) 10 gibi iyi bilinen markerlar kullanılarak doku analizlerinde yaygın olarak kullanılır – aşağıda proliferasyonun protein markerlarına bakınız.
Yöntemler şunları içerir:
- Hücre döngüsü analizi için DNA boyama boyaları
- Boya dilüsyon analizleri
- DNA sentezi sırasında nükleozid analoglarının yapıya katılması
En popüler analiz kitlerimiz şunlardır: EdU, propidyum iyodür ve CFSE.
Hücre proliferasyonu, metabolik analizler kullanılarak da ölçülebilir – bu kılavuzdaki yukarıdaki metabolik analizler bölümüne bakın.
Proliferasyonu ölçmek için DNA içeriğinin kullanılması (hücre döngüsü analizleri)
DNA boyama boyaları, hücre popülasyonlarındaki DNA içeriğini ölçmek ve hücre döngüsü durumunu analiz etmek için flow sitometride yaygın olarak kullanılır. Bu boyalar, DNA’ya bağlandıktan sonra floresan yayarlar. Hücrede bulunan DNA miktarıyla orantılı olarak bağlanırlar; bu nedenle, DNA replikasyonu geçiren ve bölünmeye hazırlanan hücreler (S ve G2 evreleri) orantılı olarak daha fazla boya alacak ve daha parlak floresan verecektir. Propidyum iyodür en yaygın kullanılan boyadır.
Avantajları:
- Yaygın olarak kullanılır
- Kolay ve anlaşılırdır
Dezavantajları:
- Bazı boyalar hücrelerin sabitlenmesini veya geçirgen hale getirilmesini gerektirir (propidyum iyodür, DAPI); bu durum genellikle floresan proteinler ve bazı yüzey markerları ile uyumsuzdur.
Boya | Araç | Açıklamalar |
Propidyum İyodür | Flow sitometri | Ex/Em 536/617 nm |
Nükleer Yeşil CCS1 | Flow sitometri | Ex/Em 490/525 nm |
Nükleer Kırmızı CCS1 | Flow sitometri | Ex/Em 490/620 nm |
DRAQ5TM | Flow sitometri | Ex/Em 633&647/665–800 nm |
DAPI | Flow sitometri | Ex/Em 358/461 |
Hoechst 33342 | Flow sitometri | Ex/Em 350/461 |
Hoechst 33258 | Flow sitometri | Ex/Em 350/461 |
7-AAD | Flow sitometri | Ex/Em 488/647 nm |
Şekil 11. Timidin (B) ve nokodazol (C) ile işlem görmüş HeLa hücreleriyle kullanılan propidyum iyodür flow sitometri kiti (ab139418). Tepe noktaları, 2N ve 4N DNA içeriğini göstermektedir.
DNA sentezleri sırasında nükleosit analoglarının yapıya katılımı
Hücre proliferasyonunu değerlendirmenin en güvenilir ve doğru yöntemi DNA sentezinin ölçülmesidir. Bu yöntem, canlı hücrelerin yeni sentezlenen DNA’ya katılma yeteneğine sahip bileşiklerle inkübe edilmesine dayanır. Bu bileşikler daha sonra bir raportör ile tespit edilebilir.
Timidin analogları, DNA replikasyonu sırasında timidinin yerini alarak DNA’ya dahil edilmek için tercih edilen bileşiklerdir. Bu, proliferasyon gösteren hücreleri ve yavru hücreleri etiketler. Ancak, bu timidin analoglarının bazı durumlarda mutasyonlara ve DNA hasarına yol açarak döngüyü etkileyebileceğinin farkında olmak önemlidir11,12.
Bromodeoksiüridin (BrdU) ve etinildeoksiüridin (EdU) analizleri, DNA replikasyonu sırasında BrdU veya EdU’nun yeni sentezlenen DNA’ya katılımını ölçer. Antikorlar kullanılarak tespit edilen BrdU’nun aksine, EdU, streptavidin-HRP aracılığıyla kolorimetrik veya florometrik tespit için bir floresan boya veya biyotin ile doğrudan kolayca etiketlenebilir. BrdU’nun daha sert olan protokolünün aksine, EdU boyaması sonraki antikor boyamalarıyla uyumludur.
Bu yöntem immünohistokimya (IHC), immünositokimya (ICC), ELISA’lar, flow sitometri ve bazı çoklu (multipleks) analizler için uygundur. Bromodeoksiüridin (BrdU) immünolojik tespit ile tespit edilebilirken, etinildeoksiüridin (EdU) için kimyasal tespit kullanılır.
Bu analizler hakkında daha fazla bilgi için hücre proliferasyonu kılavuzumuzu inceleyin.
Avantajları:
- Doğru ve güvenilir
- Yüksek ve düşük verimli seçenekler
Dezavantajları:
- Protokol uzun ve karmaşık olabilir
- DNA denatürasyonu, sonraki eş zamanlı boyama deneylerini engeller (yalnızca BrdU için geçerlidir)
Assay | Araç |
EdU | Mikrosko, flow sitometri, plaka okuyucu |
BrdU | Plaka okuyucu, mikroskop |
Şekil 12. Çoğalan HeLa hücrelerinin EdU boyaması. DNA (mavi) Hoechst 33342 (ab145597) ile boyanmıştır. Yeşil hücreler, EdU + Hoechst pozitiftir.
Boya dilüsyon analizleri
Boya dilüsyon analizlerindeki (veya floresan boya proliferasyon analizlerindeki) boyalar, birden fazla nesil boyunca hücrelerin içinde tutulur. Yavru hücreler, ana hücrelerin boyasının yarısını alır ve analizler flow sitometride gerçekleştirilir. Karboksifloresan süksinimidil ester (CFSE), en uzun süredir kullanılan boyadır.
Avantajları:
- Floresan, formaldehit ve alkol fiksasyonundan sonra da korunur
- Çok renkli analize olanak tanır
Dezavantajları:
- CFSE yüksek konsantrasyonlarda sitotoksiktir (uygun konsantrasyonlarda hücreler için toksik değildir)
Boya | Araç | Açıklamalar |
CFSE | Flow sitometri | Ex/Em 492/517 nm. Yüksek konsantrasyonlarda sitotoksiktir. |
CytoLabel Mavi | Flow sitometri, mikroskop | Ex/Em 403/454 nm |
CytoLabel Yeşil | Flow sitometri, mikroskop | Ex/Em 511/525 nm |
CytoLabel Kırmızı | Flow sitometri, mikroskop | Ex/Em 628/643 nm |
CytoLabel Turuncu | Flow sitometri, mikroskop |
Şekil 13. CFSE (ab113853) dilüsyon analizinin flow sitometri analizi.
Proliferasyonun protein markerları
Hücre proliferasyonunu incelemenin bir başka yöntemi de, çoğalan hücrelerde eksprese edilen ancak çoğalmayan hücrelerde bulunmayan spesifik proteinlere bakmaktır. Bu, proliferasyon sırasında eksprese edilen antijenlere karşı spesifik primer antikorların kullanılmasını gerektirir.
Bu antijenler tipik olarak G0 dışındaki tüm hücre döngüsü evrelerinde perinükleer veya nükleer iç bölgelerde eksprese edilir, bu da onları proliferasyon için mükemmel hücresel markerlar haline getirir. Ki67 çok popüler bir proliferasyon markerıdır ve kanserdeki tanısal ve prognostik gücü nedeniyle patoloji laboratuvarlarında rutin olarak kullanılmaktadır. PCNA da başka bir yaygın markerdır, ancak çok sayıda çalışma, çeşitli kökenlerden gelen tümörlerde hücre proliferasyonunu değerlendirirken Ki67’nin daha hassas ve spesifik olduğunu göstermiştir14, 15, 16, 17. Önemi giderek artan bir marker da MCM-2’dir ve son çalışmalar bunun kanser prognozunu belirlemede Ki67 ve PCNA’dan daha iyi bir seçenek olabileceğini düşündürmektedir18, 19.
Bununla birlikte, özellikle klinik bir bağlamda, ‘en iyi’ proliferasyon markerının hangisi olduğu konusundaki verilerin çoğu kesin değildir.
Bu immünolojik analizler, sabitlenmiş doku numuneleri ve IHC ile analiz için mükemmeldir.
Avantajları:
- Doğru ve güvenilir
- Geniş destekleyici veri havuzu
- Bazı durumlarda klinik tanısal ve prognostik değer
Dezavantajları:
- Sınırlı yüksek verimli seçenekler
- Sonuçların skorlanması sübjektif olabilir
- Klinik bir ortamda ‘en iyi’ hücre proliferasyonu markerı konusunda çelişkili veriler
Şekil 14. Bir anti-PCNA antikoru [PC10] (ab29) ile etiketlenmiş, yetişkin zebra balığı bağırsağından alınan dondurulmuş kesitlerin immünohistokimyasal analizi.
Şekil 15. Bir anti-Ki67 antikoru (ab15580) kullanılarak etiketlenmiş, fare dalağından alınan formalin/PFA ile sabitlenmiş parafine gömülü kesitlerin immünohistokimyasal analizi.
Şekil 16. Bir anti-MCM2 antikoru (ab4461) ile etiketlenmiş, insan küçük hücreli akciğer kanseri dokusundan alınan formalin/PFA ile sabitlenmiş parafine gömülü kesitlerin immünohistokimyasal analizi.
Klonojenisite analizleri
Yüksek verim için az kullanılsa da, hücre proliferasyonunu analiz etmenin klasik yöntemi klonojenik/klonojenisite analizi kullanmaktır. Bu analizde, hücreler düşük bir yoğunlukta plakalanır ve ardından oluşan koloni sayısı sayılır.
Avantajları:
- Düşük müdahale riski20
Dezavantajları:
- Manuel sayım nedeniyle hataya açık olması
- Zaman alıcı olması
- Yalnızca bitişik hücrelerle sınırlı olması
Yaşlanma analizleri
Yaşlanmanın tümör baskılayıcı bir mekanizma ve yaşlanmanın altında yatan bir neden olduğu düşünülmektedir. Yaşlanma, hücrelerin canlı kaldığı ancak aktif olarak bölünmediği, durdurulmuş bir metabolik durumu temsil eder.
Yaşlanan hücrelerin en yaygın markerı, endojen lizozomal beta-galaktosidazın (SA-beta-gal) aşırı ekspresyonu ve birikmesidir. Beta-gal aktivitesi, kolorimetrik veya florometrik bir substrat kullanılarak tespit edilir.
Avantajları:
- Hücreler veya dokular için uygundur
- Basit
- Güvenilir
Dezavantajları:
- Hücrelerin fiksasyonunu gerektirir (yalnızca kolorimetrik analiz için geçerlidir)
- Belirli hücreler (osteoklastlar ve makrofajlar) daha yüksek seviyelerde β-gal aktivitesine sahiptir, bu da potansiyel olarak yalancı pozitiflere yol açabilir21
Assay | Araç |
Beta-gal | Mikroskop, plaka okuyucu |
Beta-gal | Flow sitometri |
Çoğalan hücrelerin skorlanması
Proliferasyon derecesinin skorlanması özellikle klinik bir ortamda önemlidir. Örneğin, Ki67 pozitif hücrelerin yüzdesi, kanserin şiddetini ve seyrini skorlamak için kullanılabilir. Proliferasyon proteinleri yöntemleriyle kullanılabilen, her birinin kendi güçlü yönleri ve kısıtlamaları olan birkaç skorlama tekniği mevcuttur.
Çoğalan hücrelerin belirlenmesi ve skorlanması hakkında daha fazla bilgi için eksiksiz proliferasyon kılavuzumuzu inceleyin.
Kaynaklar
- Stoddart, M. J. Cell viability assays: introduction Methods Mol Biol 740 ,1–6 (2011)
- Giralt, A.,, Fajas, L. Editorial: Metabolic Adaptation to Cell Growth and Proliferation in Normal and Pathological Conditions Frontiers in Endocrinology 8 ,362 (2017)
- Cobb, L. Cell Proliferation Assays and Cell Viability Assays Materials and Methods 3 ,2799 (2013)
- Riss, T. L, et al Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences Assay Guidance Manual , (2004)
- Perry, S.,, Norman, J.,, Barbieri, J.,, Brown, E.,, Gelbard, H. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide BioTechniques 50 ,98-115 (2011)
- Aslantürk, Ö. S. In vitro cytotoxicity and cell viability assays: principles, advantages, and disadvantages in Genotoxicity: a predictable risk to our actual world (ed. Larramendy, M. L. & Soloneski, S.) IntechOpen ,1-17 (2018)
- Perfetto, S.,, et aL Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry Journal of Immunological Methods 313 ,199-208 (2006)
- Matson, J.,, Cook, J. Cell cycle proliferation decisions: the impact of single cell analyses The FEBS Journal 284 ,362-375 (2016)
- Juríková, M.,, Danihel, Ľ.,, Polák, Š., Varga, I. Ki67, PCNA, and MCM proteins: Markers of proliferation in the diagnosis of breast cancer Acta Histochemica 118 ,544-552 (2016)
- Breunig, J. J.,, Arellano, J. I.,, Macklis, J. D.,, Rakic, P. Everything that Glitters Isn’t Gold: A Critical Review of Postnatal Neural Precursor Analyses Cell Stem Cell 1 ,612–627 (2007)
- Anda, S.,, Boye, E.,, Grallert, B. Cell-cycle analyses using thymidine analogues in fission yeast PLoS One 9 ,1–9 (2014)
- Tuttle, A.H.,, Rankin, M.M.,, Teta, M.,, et al Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue J Vis Exp 46 ,2166 (2010)
- Oka, S.,, Uramoto, H.,, Shimokawa, H.,, Iwanami, T.,, Tanaka, F. The expression of Ki-67, but not proliferating cell nuclear antigen, predicts poor disease free survival in patients with adenocarcinoma of the lung Anticancer Res 31 ,4277–4282 (2011)
- Mateoiu, C.,, Pirici, A.,, Bogdan, F. L. mmunohistochemical nuclear staining for p53, PCNA, ki-67 and bcl-2 in different histologic variants of basal cell carcinoma. Rom. J. Morphol. Embryol 52 ,315–319 (2011)
- Salehinejad, J.,, et al Immunohistochemical detection of p53 and PCNA in ameloblastoma and adenomatoid odontogenic tumor Oral Sci 53 ,213–217 (2011)
- Bologna-Molina, R.,, Mosqueda-Taylor, A.,, Molina-Frechero, N.,, Mori-Estevez, A. D.,, Sánchez-Acuña, G. Comparison of the value of PCNA and Ki-67 as markers of cell proliferation in ameloblastic tumors Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal 18 , (2013)
- Carreón-Burciaga, R. G.,, González-González, R.,, Molina-Frechero, N.,, Bologna-Molina, R. Immunoexpression of Ki-67, MCM2, and MCM3 in Ameloblastoma and Ameloblastic Carcinoma and Their Correlations with Clinical and Histopathological Patterns Dis. Markers , (2015)
- Joshi, S.,, et al Digital imaging in the immunohistochemical evaluation of the proliferation markers Ki67, MCM2 and Geminin, in early breast cancer, and their putative prognostic value BMC Cancer 15 ,546 (2015)
- Gutiérrez, L.,, et al Nanotechnology in Drug Discovery and Developmen Comprehensive Medicinal Chemistry III ,264-295 (2017)
- Noren Hooten, N.,, Evans, M. K. Techniques to induce and quantify cellular senescence J. Vis. Exp. 123 (e55533), (2017)
